METABOLISMO
Conjunto de reacciones químicas que tienen lugar dentro de las células de los organismos vivos, las cuales transforman energía, conservan su identidad y se reproducen. Las células tienen una serie de enzimas o catalizadores que se encargan de activar, controlar y terminar todas estas reacciones, cada una está coordinada con otras que se producen en el organismo.
Hay dos grandes procesos metabólicos:
ANABOLISMO: fase biosintética o metabolismo constructivo, Es el conjunto de las reacciones de síntesis necesarias para el crecimiento de nuevas células y el mantenimiento de todos los tejidos. Las reacciones anabólicas incluyen la biosíntesis enzimática de los ácidos nucleícos, los lípidos, los polisacáridos y las proteínas; todos estos procesos necesitan la energía química suministrada por el ATP.
CATABOLISMO: fase degradativa. El catabolismo es un proceso centrado en la producción de energía necesaria para la realización de todas las actividades físicas externas e internas. El catabolismo engloba también el mantenimiento de la temperatura corporal e implica la degradación de las moléculas químicas complejas (glúcidos, lípidos y proteínas) en sustancias más sencillas (ácido acético, amoníaco, ácido láctico, dióxido de carbono o urea), que constituyen los productos de desecho expulsados del cuerpo a través de los riñones, el intestino, los pulmones y la piel. En dicha degradación se libera energía química que es almacenada en forma de ATP hasta que es requerida por los diferentes procesos anabólicos.
Las reacciones anabólicas y catabólicas siguen rutas metabólicas; ambos tipos de rutas se combinan para producir compuestos finales específicos y esenciales para la vida. Las rutas anabólicas parten de compuestos químicos relativamente simples y difusos llamados intermediarios. Estas vías utilizan la energía que se obtiene en las reacciones catalizadas por enzimas y se orientan hacia la producción de compuestos finales, en especial macromoléculas en forma de hidratos de carbono, proteínas y grasas. Valiéndose de otras secuencias enzimáticas y moviéndose en sentido contrario, las rutas catabólicas disgregan las macromoléculas complejas en compuestos químicos menores que se utilizan como bloques estructurales relativamente simples.
Cuando el anabolismo supera en actividad al catabolismo, el organismo crece o gana peso; si es el catabolismo el que supera al anabolismo, como ocurre en periodos de ayuno o enfermedad, el organismo pierde peso. Cuando ambos procesos están equilibrados, decimos que el organismo se encuentra en equilibrio dinámico.
FUENTES DE ENERGÍA METABÓLICA:
Para cumplir las dos primeras leyes de la termodinámica, el organismo vivo no puede ni crear ni destruir energía, sólo transformarla de unas formas en otras. Así, la clorofila vegetal, captura la energía de la luz solar y la utiliza para alimentar la síntesis de células vegetales vivas a partir de sustancias inorgánicas como dióxido de carbono, agua y amoníaco. Esta energía, en forma de productos de alto contenido energético (hidratos de carbono, grasas y proteínas) es ingerida por los animales herbívoros y por los carnívoros secundarios, para los que constituye la única fuente energética y de compuestos químicos para la construcción de células.
Todos los organismos vivos obtienen la energía del Sol. Cuando se reproduce, cada uno —sea una planta verde, un herbívoro o un carnívoro— transmite ciertas instrucciones genéticas sobre la forma de interceptar, transformar y liberar la energía al medio ambiente durante su ciclo vital. El metabolismo abarca los procesos por medio de los cuales las células interceptan químicamente y distribuyen la energía que de forma constante pasa por su organismo. Las células devuelven la energía libre en forma de calor.
ALIMENTACIÓN Y ENERGÍA
Todos los organismos dependen de la energía contenida en los alimentos para vivir. Las plantas sintetizan hidratos de carbono, grasas y proteínas durante los periodos en que reciben luz solar, y almacenan estos compuestos para utilizarlos cuando el crecimiento les obliga a consumir grandes cantidades de energía.
La energía que contienen los alimentos se expresa en calorías o julios; en el metabolismo energético, la unidad utilizada es la kilocaloría, que es la cantidad de energía necesaria para elevar en 1 ºC la temperatura de 1 kg de agua. Los hidratos de carbono tienen un contenido medio de 4,1 kilocalorías (17 kilojulios) por gramo; las proteínas de 4,2 kilocalorías (17,5 kilojulios), y las grasas de 9,3 kilocalorías (39 kilojulios).
Los organismos recurren a unos u otros tipos de alimentos para satisfacer necesidades especiales. El zorro ártico, depende casi únicamente de las grasas, ligeras y de elevado rendimiento energético. Las semillas, que deben pesar poco y, almacenar grandes cantidades de energía, contienen casi siempre un elevado porcentaje de grasas y aceites. Por el contrario, los árboles cuentan con abundante espacio de almacenamiento en las raíces, y utilizan casi exclusivamente hidratos de carbono en forma de sacarosa.
Una característica exclusiva de los organismos vivos es la capacidad para consumir los propios tejidos una vez agotadas todas las demás fuentes de energía; otra es que, en lugar de liberar la energía de manera radical utilizando compuestos de combustión rápida, la liberan paso a paso a lo largo de cadenas de reacciones químicas. La energía que desprende una reacción sirve para iniciar otra, de modo que se libera poco a poco a costa de una fatiga celular mínima.
Las reacciones químicas en los tejidos, sujetos tanto a degradación catabólica como a nueva síntesis anabólica, son exergónicas o endergónicas. Las exergónicas, propias del catabolismo, liberan energía a partir del sistema de sustancias en reacción; las endergónicas, que ocurren durante el anabolismo, necesitan tomar energía del exterior. Cuando las sustancias que intervienen en una reacción endergónica han absorbido energía, pueden iniciar una reacción exergónica. Las reacciones oxidativas desencadenan reacciones endergónicas dentro de las células.
El metabolismo es un conjunto de innumerables reacciones que desprenden o absorben energía, conectadas unas a otras en una red intracelular de interrelaciones.
La energía química se intercambia en todas las células vivas por medio de trifosfato de adenosina o ATP, un compuesto que tiene enlaces fosfato ricos en energía. Las plantas utilizan ATP para transferir energía química desde las fuentes fotosintéticas. Al transferir energía a otras moléculas, el ATP pierde uno o dos de sus grupos fosfato, y se transforma en difosfato de adenosina (ADP) o monofosfato de adenosina (AMP). Las plantas transforman estos dos compuestos de nuevo en ATP a costa de la energía química generada en las células fotosintéticas a partir de energía solar, mientras que los animales utilizan la energía química producida en las células heterotróficas.
REGULACIÓN
Las enzimas reguladoras o limitadoras de velocidad son elementos primordiales de estas reacciones. Cada una de estas moléculas enzimáticas, tiene un punto específico o activo que encaja en el sustrato o compuesto sobre el cual actúa la enzima y se forma un producto. La precisión con que las enzimas limitadoras de la velocidad y los sustratos se acoplan para iniciar reacciones impide que las reacciones se produzcan de forma indiscriminada dentro de las células, donde fluyen compuestos químicos muy diversos. Cantidades mínimas de una enzima de este tipo pueden inducir cambios profundos en el metabolismo celular.
El metabolismo, está también regulado por el sistema nervioso, el páncreas, la glándula pituitaria y las glándulas suprarrenales. Las hormonas que se vierten en el torrente sanguíneo, alcanzan los tejidos diana y en muchos casos modifican la permeabilidad de las membranas celulares; alterando las cantidades de sustancias que entran en las células y salen de ellas. Las hormonas, que también afectan al metabolismo vegetal, cambian las rutas metabólicas, para ello modifican los puntos catalíticos de las enzimas limitantes de la velocidad.
METABOLISMO DE LOS ALIMENTOS
Aunque los tres tipos principales de alimentos —proteínas, hidratos de carbono y grasas— tienen distintas composiciones químicas y siguen rutas bioquímicas independientes, en cierta fase de las reacciones metabólicas todos ellos forman compuestos de carbono. Estos compuestos siguen la misma pauta de reacciones oxidativas que terminan por rendir dióxido de carbono y agua, que se excretan del organismo. Cada etapa está formada por varias reacciones bioquímicas muy complejas y convergentes.
• PROTEINAS
Las proteínas poseen gran variedad de funciones:
*actúan como vehículos de transporte, como catalizadores, como elementos estructurales, en los sistemas contráctiles y como elementos nutritivos de reserva.
Las proteínas compuestas por una o varias cadenas polipeptídicas, se absorben en el aparato digestivo y se descomponen por hidrólisis en veinte aminoácidos esenciales, necesarios para el anabolismo celular. Los aminoácidos pueden experimentar nuevas alteraciones químicas que los transforman en compuestos de secreción interna, como hormonas, enzimas digestivas y elementos de protección (anticuerpos).
Los aminoácidos que no hacen falta para reponer las células y fluidos orgánicos se catabolizan en dos pasos:
*La desaminación oxidativa, que consiste en la separación de la porción de la molécula que contiene nitrógeno, se combina con carbono y oxígeno para formar urea, amoníaco y ácido úrico, que son los productos nitrogenados del metabolismo proteico.
*Los aminoácidos experimentan nuevas degradaciones químicas y forman nuevos compuestos que a su vez son catabolizados en rutas bioquímicas a las que se unen compuestos similares derivados del catabolismo de hidratos de carbono y grasas. Los productos finales de estas porciones proteicas son dióxido de carbono y agua.
• HIDRATOS DE CARBONO
Los hidratos de carbono se absorben en el aparato digestivo en forma de azúcares, en especial glucosa, el principal combustible de la mayoría de los organismos vivos. Ésta se mantiene en la sangre a concentración constante y se cataboliza con facilidad para satisfacer las necesidades energéticas del organismo. En este proceso, la molécula de glucosa se descompone en compuestos de carbono que se oxidan a dióxido de carbono y agua, y se excretan. La glucosa que no se utiliza para la producción de energía se almacena en forma de glucógeno en el hígado y los músculos. Cuando estas reservas se colman, la glucosa se convierte en grasa y se deposita en el tejido adiposo. Las plantas también son capaces de almacenar glucosa pero en forma de polímeros, almidón y celulosa.
• GRASAS
En la digestión, las grasas se descomponen en glicerina y ácidos grasos. Éstos se transforman mediante síntesis en triglicéridos, compuestos de colesterol y fosfolípidos, que son grasas combinadas con fósforo que circulan en la sangre. Las grasas pueden sintetizarse en las estructuras del organismo o almacenarse en el tejido adiposo en grandes células especializadas en el almacenamiento de grasa (adipocitos), de las que se toman cuando es necesario. En las fibras del músculo cardiaco se encuentran también pequeñas gotas de grasa que son utilizadas como fuente energética al transformarse en ácidos grasos. Como la glucosa, su catabolismo da lugar a compuestos carbonados que se descomponen en dióxido de carbono y agua.
• VITAMINAS
Las vitaminas son compuestos orgánicos esenciales para estimular el metabolismo de aminoácidos, hidratos de carbono y grasas en los organismos vivientes. Algunos de estos organismos, sintetizan vitaminas, a menudo en cantidades superiores a las que necesitan, ej: plantas verdes.
ERRORES METABÓLICOS CONGÉNITOS
Si una enzima falta del organismo a consecuencia de algún defecto hereditario, queda bloqueada la transformación química que debería regular. En consecuencia, hay productos celulares que dejan de sintetizarse o catabolizarse, de modo que se acumula una cantidad excesiva de otro producto metabólico que lesiona los tejidos, o impide que ciertos materiales intracelulares atraviesen la membrana celular.
El efecto de ciertos errores metabólicos se manifiesta en la primera infancia, otros sólo se observan en la madurez. Algunos de estos pueden ser mortales, otros no parecen ejercer ningún efecto nocivo, la enfermedad llamada fenilcetonuria se debe a un error en el metabolismo de los aminoácidos; afecta a los lactantes y determina el bloqueo del metabolismo del aminoácido fenilalanina; los productos metabólicos acumulados pueden causar un retraso en el desarrollo cerebral normal.
La galactosemia es un error del metabolismo de los hidratos de carbono que consiste en la ausencia de la enzima necesaria para que la galactosa se transforme en glucosa; la incapacidad para metabolizar los azúcares de la leche determina la acumulación de galactosa en la sangre, lo que puede lesionar el cerebro y el hígado, y la formación de cataratas y el retraso mental.
BIBLIOGRAFÍA:
Duncan, G. G. enfermedades del metabolismo. 2vols. Barcelona: ed. Salvat, 1979.
Gil Martínez, Francisco. Elementos de fisiología vegetal: metabolismo. Madrid: ed. Mundi-prensa, 1995.
Meléndez-Hevia, Enrique, La evolución del metabolismo: hacia la simplicidad. Madrid: EUDEMA, 1993.
es.wikipedia.org, la enciclopedia libre/GOOGLE.
jueves, 15 de octubre de 2009
jueves, 1 de octubre de 2009
METODOS DE ESTUDIO Y CONTROL DE MICROORGANISMOS
METODOS DE ESTUDIO Y CONTROL DE MICROORGANISMOS
MICROORGANISMOS:
• Protozoos
• Algas
• Hongos
• Bacterias
• Virus
TIPOS DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIO ÓPTICO
Microscopio de campo claro
Microscopio de campo oscuro
Microscopio de contraste de fases
Microscopio de fluorescencia
Microscopio de laser con focal
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
De barrido : haz de electrones que barre la superficie de un objeto sólido (SEM), resolución 7nm
De transmisión: haz de electrones que atraviesa cortes ultra finos de una muestra (TEM), resolución 5A°
MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA (MFA)
TIPOS DE TINCIONES
TINCIÓN SIMPLE
Gram+: peptidoglucano, membrana plasmática.
Gram-: peptidoglucano, membrana plasmática, espacio periplásmico, lipopolisacárido y proteína.
TINCIÓN DIFERENCIAL
Tinción de gram/ tinción de ziehl-neelsen
TINCIONES ESPECÍFICAS
*tinción de cápsulas, tinción de flagelos y tinción de esporas.
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS
Siembra por estría en placa petri
Vertido en placa
Extensión en placa
-Diluciones seriadas
-Asa de Digralsky
MEDIOS DE CULTIVOS
Medios definidos
-Glucosa…………. 10 g
-(NH4)2SO4…………. 2 g
-CaCl2 ……….......0,01 g
-FeSO4.7H2O…..0,005 g
-MgSO4.7H2O…..0,02 g
-Agua destilada…… 1 L
-Agar……………… 15 g
Medios complejos: caldo nutritivo
-Peptona…………… 5 g
-Extracto de carne.. 3 g
-NaCl…………………8 g
-Agua destilada…….1 L
Medios selectivos y diferenciales
-Agar entérico de hektoen (enterobacterias patógenas)
-Agar Baird-Parker (estafilococos).
-Agar levine (EMB)
-Agar Wilson-Blair (salmonella)
Medios de enriquecimiento
-Caldo Giolitti-Cantoni (estafilococos)
-Caldo Müller-Kauffmann (salmonella)
CRECIMIENTO Y CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS
NUTRICIÓN MICROBIANA:
REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS
Fuente de carbono:
-CO2: Autótrofos
-Compuestos orgánicos: heterótrofos
-Fuente de energía: generación de ATP y poder reductor
-Luz: fototrofos
-Compuestos químicos: quimiotrofos
-compuestos orgánicos: quimioorganotrofos
-compuestos inorgánicos: quimiolitotrofos
TIPOS NUTRICIONALES DE LOS MICROORGANISMOS
-Fotoautótrofos
-Fotoheterótrofos
-Quimiolitotrofos autótrofos
-Quimiolitotrofos heterótrofos: mixotrofos
-Quimioorganotrofos heterótrofos (quimioheterótrofos)
CADENA METABÓLICA
-Entrada de nutrientes
-Reacciones catabólicas
-Biosíntesis
-Polimerización
-Ensamblaje
FUENTE DE NITROGENO
• Inorgánica:
- NH4+
- NO3-
- N2
• Compuestos orgánicos nitrogenados
-aminoácidos
- bases nitrogenadas
CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES
DIVISIÓN CELULAR EN PROCARIOTAS:
• FISIÓN BINARIA: el tiempo para completar el ciclo depende de factores nutricionales y genéticos.
-contraste de fases
-tinción de nucleoide
-tinción del anillo ftsz
-tinción de nucleoide y anillo.
CRECIMIENTO DE POBLACIONES
-velocidad de crecimiento
-tiempo de generación
-expresión del crecimiento
EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO
• TEMPERATURA
-mínima
-máxima
-óptima
• TIPOS DE MICROORGANISMOS SEGÚN SU TEMPERATURA ÓPTIMA
*Psicrófilos: 4°: polaromonas vacuolata
*Mesófilos: 39°: escherichia coli
*Termófilos: 60°: bacillus stearothermophilus
*Hipertermófilos: 88°: thermococcus celer
*Hipertermófilos: 106°: pyrolobus fumarii
• SALINIDAD
-HALÓFILOS: discretos (1-6%) y moderados (6-15%) de NaCl
-HOLOTOLERANTE: crecen en amplio rango de actividad de agua.
-HLÓFILOS EXTREMOS: 17-36% NaCl
TIPOS DE MICROORGANISMOS EN RELACIÓN CON EL OXIGENO
• AEROBIOS
• ANAEROBIOS
• FACULTATIVOS
• MICROAERÓFILOS
• ANAEROBIOS AEROTOLERANTES
MÉTODOS DE CONTROL MICROBIANO: TERMINOLOGÍA
• ESTERILIZACIÓN: destrucción total de formas vivas en material inerte
• DESINFECCIÓN: destrucción de agentes infecciosos en estado vegetativo en material inerte = desinfectantes
• ANTISEPSIA: destrucción de agentes infecciosos en estado vegetativo en la superficie de tejidos vivos = antisépticos
• SANEAMIENTO: reducción microbiana en material inerte o tejidos vivos hasta niveles seguros = limpieza mecánica de productos
• QUIMIOTERAPIA: control crecimiento microbiano dentro de un hospedador = agentes quimioterapéuticos antimicrobianos.
CONTROL DE CRECIMIENTO MICROBIANO
MÉTODOS FISICOS
ESTERILIZACIÓN POR CALOR
• CALOR SECO
-flameado (incineración)
-horno pasteur 170°C/ 1-2h
• CALOR HUMEDO
-hervido 100°C
-tindalización 100°C
-vapor de agua a presión: 121°C/20mn
-esterilización a temperatura ultraelevada (UHT) 4°C=1s, 140°C=3s.
-pasteurización: reducción de población bacteriana y alargamiento de vida útil 71-72° =15s
ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
• FILTRACIÓN DE SOLUCIONES TERMO SENSIBLES
• FILTRACIÓN DEL AIRE:
-algodones en los tubos de vidrio, mascarillas
-Filtro de alta eficacia de retención de partículas (HEPA)
-Cabinas de seguridad biológica de flujo laminar
- Habitaciones especiales de hospitales
ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN: Depende de la energía, intensidad y duración.
• IONIZANTES:
-rayos y: suministros quirúrgicos, materiales de laboratorio, industrias de alimentos y productos cárnicos.
-rayos de electrones
-rayos x
• NO IONIZANTES
-luz UV: desinfección de superficies y aire.
-microondas
OTROS MÉTODOS
• CONTROL POR BAJAS TEMPERATURAS
-congelación
-refrigeración (0-4°C)
• DESECACIÓN
-evaporación (industria alimentaria)
-liofilización (conservar cultivos)
-soluciones hipertónicas: salazón, miel, mermeladas.
MÉTODOS QUÍMICOS
• ANTISÉPTICOS
• DESINFECTANTES
• ESTERILIZANTES
Propiedades
*Inocuo para las personas y no corrosivo para materiales
* Amplio espectro
* Eficaz a diluciones altas y en presencia de materia orgánica
* Soluble en agua
* Estable, inodoro y económico
ANTISÉPTICOS
• Alcohol (60-85% etanol) piel
• Fenoles (hexaclorofeno, triclosan, clorhexidina): Jabones, lociones, cosméticos y desodorantes
• Detergentes catiónicos (cloruro de benzalconio) Jabones y lociones
• Peróxido de hidrógeno al 3% Piel
• Compuestos de yodo (Betadine) Piel
• Nitrato de Plata Ojos neonatos
DESINFECTANTES Y ESTERILIZANTES
• ALCOHOL 60-85% etanol: para instrumentales médicos.
• GAS CLORO: para suministros de agua
• COMPUESTOS COLORADOS: equipos de industria alimentaria
• DETERGENTES CATIÓNICOS (amonio cuaternario): para instrumental médico, alimentos y equipos de industrias lácteas.
• FORMALDEHÍDO (3-8%): superficies
• SULFATO DE COBRE: algicida
• GAS: esterilizante de material termosensible.
AGENTES MICROBIANOS: antibióticos y quimioterapéuticos de síntesis
• Penicilina
• Sulfanilamida
TIPOS DE AGENTES ANTIMICROBIANOS
• Bacteriostático
• Bactericida
• Bacteriolítico
ANTIBIOTICOS
* Microorganismos productores
• BACTERIAS
-actinomicetos 4600
-bacillus 950
• HONGOS 1600
• PLANTAS
• ANIMALES
PROBLEMAS ACTUALES EN TERAPIA
• AUMENTO DE RESISTENCIAS
-abuso y mal uso de los antibióticos
-enfermedades crónicas
• SOLUCIONES
-uso restringido de los antibióticos
-búsqueda de nuevos antimicrobianos y mejora de los ya existentes.
MICROORGANISMOS:
• Protozoos
• Algas
• Hongos
• Bacterias
• Virus
TIPOS DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIO ÓPTICO
Microscopio de campo claro
Microscopio de campo oscuro
Microscopio de contraste de fases
Microscopio de fluorescencia
Microscopio de laser con focal
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
De barrido : haz de electrones que barre la superficie de un objeto sólido (SEM), resolución 7nm
De transmisión: haz de electrones que atraviesa cortes ultra finos de una muestra (TEM), resolución 5A°
MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA (MFA)
TIPOS DE TINCIONES
TINCIÓN SIMPLE
Gram+: peptidoglucano, membrana plasmática.
Gram-: peptidoglucano, membrana plasmática, espacio periplásmico, lipopolisacárido y proteína.
TINCIÓN DIFERENCIAL
Tinción de gram/ tinción de ziehl-neelsen
TINCIONES ESPECÍFICAS
*tinción de cápsulas, tinción de flagelos y tinción de esporas.
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS
Siembra por estría en placa petri
Vertido en placa
Extensión en placa
-Diluciones seriadas
-Asa de Digralsky
MEDIOS DE CULTIVOS
Medios definidos
-Glucosa…………. 10 g
-(NH4)2SO4…………. 2 g
-CaCl2 ……….......0,01 g
-FeSO4.7H2O…..0,005 g
-MgSO4.7H2O…..0,02 g
-Agua destilada…… 1 L
-Agar……………… 15 g
Medios complejos: caldo nutritivo
-Peptona…………… 5 g
-Extracto de carne.. 3 g
-NaCl…………………8 g
-Agua destilada…….1 L
Medios selectivos y diferenciales
-Agar entérico de hektoen (enterobacterias patógenas)
-Agar Baird-Parker (estafilococos).
-Agar levine (EMB)
-Agar Wilson-Blair (salmonella)
Medios de enriquecimiento
-Caldo Giolitti-Cantoni (estafilococos)
-Caldo Müller-Kauffmann (salmonella)
CRECIMIENTO Y CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS
NUTRICIÓN MICROBIANA:
REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS
Fuente de carbono:
-CO2: Autótrofos
-Compuestos orgánicos: heterótrofos
-Fuente de energía: generación de ATP y poder reductor
-Luz: fototrofos
-Compuestos químicos: quimiotrofos
-compuestos orgánicos: quimioorganotrofos
-compuestos inorgánicos: quimiolitotrofos
TIPOS NUTRICIONALES DE LOS MICROORGANISMOS
-Fotoautótrofos
-Fotoheterótrofos
-Quimiolitotrofos autótrofos
-Quimiolitotrofos heterótrofos: mixotrofos
-Quimioorganotrofos heterótrofos (quimioheterótrofos)
CADENA METABÓLICA
-Entrada de nutrientes
-Reacciones catabólicas
-Biosíntesis
-Polimerización
-Ensamblaje
FUENTE DE NITROGENO
• Inorgánica:
- NH4+
- NO3-
- N2
• Compuestos orgánicos nitrogenados
-aminoácidos
- bases nitrogenadas
CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES
DIVISIÓN CELULAR EN PROCARIOTAS:
• FISIÓN BINARIA: el tiempo para completar el ciclo depende de factores nutricionales y genéticos.
-contraste de fases
-tinción de nucleoide
-tinción del anillo ftsz
-tinción de nucleoide y anillo.
CRECIMIENTO DE POBLACIONES
-velocidad de crecimiento
-tiempo de generación
-expresión del crecimiento
EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO
• TEMPERATURA
-mínima
-máxima
-óptima
• TIPOS DE MICROORGANISMOS SEGÚN SU TEMPERATURA ÓPTIMA
*Psicrófilos: 4°: polaromonas vacuolata
*Mesófilos: 39°: escherichia coli
*Termófilos: 60°: bacillus stearothermophilus
*Hipertermófilos: 88°: thermococcus celer
*Hipertermófilos: 106°: pyrolobus fumarii
• SALINIDAD
-HALÓFILOS: discretos (1-6%) y moderados (6-15%) de NaCl
-HOLOTOLERANTE: crecen en amplio rango de actividad de agua.
-HLÓFILOS EXTREMOS: 17-36% NaCl
TIPOS DE MICROORGANISMOS EN RELACIÓN CON EL OXIGENO
• AEROBIOS
• ANAEROBIOS
• FACULTATIVOS
• MICROAERÓFILOS
• ANAEROBIOS AEROTOLERANTES
MÉTODOS DE CONTROL MICROBIANO: TERMINOLOGÍA
• ESTERILIZACIÓN: destrucción total de formas vivas en material inerte
• DESINFECCIÓN: destrucción de agentes infecciosos en estado vegetativo en material inerte = desinfectantes
• ANTISEPSIA: destrucción de agentes infecciosos en estado vegetativo en la superficie de tejidos vivos = antisépticos
• SANEAMIENTO: reducción microbiana en material inerte o tejidos vivos hasta niveles seguros = limpieza mecánica de productos
• QUIMIOTERAPIA: control crecimiento microbiano dentro de un hospedador = agentes quimioterapéuticos antimicrobianos.
CONTROL DE CRECIMIENTO MICROBIANO
MÉTODOS FISICOS
ESTERILIZACIÓN POR CALOR
• CALOR SECO
-flameado (incineración)
-horno pasteur 170°C/ 1-2h
• CALOR HUMEDO
-hervido 100°C
-tindalización 100°C
-vapor de agua a presión: 121°C/20mn
-esterilización a temperatura ultraelevada (UHT) 4°C=1s, 140°C=3s.
-pasteurización: reducción de población bacteriana y alargamiento de vida útil 71-72° =15s
ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
• FILTRACIÓN DE SOLUCIONES TERMO SENSIBLES
• FILTRACIÓN DEL AIRE:
-algodones en los tubos de vidrio, mascarillas
-Filtro de alta eficacia de retención de partículas (HEPA)
-Cabinas de seguridad biológica de flujo laminar
- Habitaciones especiales de hospitales
ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN: Depende de la energía, intensidad y duración.
• IONIZANTES:
-rayos y: suministros quirúrgicos, materiales de laboratorio, industrias de alimentos y productos cárnicos.
-rayos de electrones
-rayos x
• NO IONIZANTES
-luz UV: desinfección de superficies y aire.
-microondas
OTROS MÉTODOS
• CONTROL POR BAJAS TEMPERATURAS
-congelación
-refrigeración (0-4°C)
• DESECACIÓN
-evaporación (industria alimentaria)
-liofilización (conservar cultivos)
-soluciones hipertónicas: salazón, miel, mermeladas.
MÉTODOS QUÍMICOS
• ANTISÉPTICOS
• DESINFECTANTES
• ESTERILIZANTES
Propiedades
*Inocuo para las personas y no corrosivo para materiales
* Amplio espectro
* Eficaz a diluciones altas y en presencia de materia orgánica
* Soluble en agua
* Estable, inodoro y económico
ANTISÉPTICOS
• Alcohol (60-85% etanol) piel
• Fenoles (hexaclorofeno, triclosan, clorhexidina): Jabones, lociones, cosméticos y desodorantes
• Detergentes catiónicos (cloruro de benzalconio) Jabones y lociones
• Peróxido de hidrógeno al 3% Piel
• Compuestos de yodo (Betadine) Piel
• Nitrato de Plata Ojos neonatos
DESINFECTANTES Y ESTERILIZANTES
• ALCOHOL 60-85% etanol: para instrumentales médicos.
• GAS CLORO: para suministros de agua
• COMPUESTOS COLORADOS: equipos de industria alimentaria
• DETERGENTES CATIÓNICOS (amonio cuaternario): para instrumental médico, alimentos y equipos de industrias lácteas.
• FORMALDEHÍDO (3-8%): superficies
• SULFATO DE COBRE: algicida
• GAS: esterilizante de material termosensible.
AGENTES MICROBIANOS: antibióticos y quimioterapéuticos de síntesis
• Penicilina
• Sulfanilamida
TIPOS DE AGENTES ANTIMICROBIANOS
• Bacteriostático
• Bactericida
• Bacteriolítico
ANTIBIOTICOS
* Microorganismos productores
• BACTERIAS
-actinomicetos 4600
-bacillus 950
• HONGOS 1600
• PLANTAS
• ANIMALES
PROBLEMAS ACTUALES EN TERAPIA
• AUMENTO DE RESISTENCIAS
-abuso y mal uso de los antibióticos
-enfermedades crónicas
• SOLUCIONES
-uso restringido de los antibióticos
-búsqueda de nuevos antimicrobianos y mejora de los ya existentes.
RESUMEN DE LAS BACTERIAS
Dominio: Es cada una de las tres subdivisiones principales en que se clasifican los seres vivos: Archaea, Bacteria y Eukarya. Los dos primeros dominios incluyen a los organismos procariotas (células sin núcleo) mientras que el dominio Eukarya engloba a los organismos eucariotas (células con núcleo).
Sin embargo Carl Woese creó una nueva categoría taxonómica, por encima de la de reino, denominada dominio de seres vivos llamado Archaea, (arquebacterias) distinto de los dominios Bacteria (también agrupa organismos procariontes) y Eukarya (organismos eucariontes).
LAS BACTERIAS
Las bacterias son seres unicelulares, es decir que están formadas por una única célula. Esta célula está viva y por lo tanto crece, se alimenta, se reproduce y utiliza energía.
Las bacterias son células procariotas, es decir sin núcleo. Al no tener núcleo, el material genético flota en el citoplasma, algunas son autótrofas que producen su propio alimento, otras son heterótrofas que absorben nutrientes del medio ambiente alimentándose de restos de animales y vegetales carecen de organelos rodeados por membranas, con pared celular de peptidoglucano, DNA en forma de anillos- plásmidos, no tienen cromosomas.
Algunas bacterias tienen uno o varios flagelos, una especie de pelos especiales que permiten que la bacteria se mueva. Los flagelos ayudan a la bacteria a desplazarse en busca de alimento o a alejarse de las cosas que pueden hacerla daño, PILI: para el intercambio de material genético, CAPSULAS: para protegerse del medio ambiente, se reproducen por fisión binaria es decir, que en pocos minutos alargándose y dividiéndose por la mitad en dos. Estas dos bacterias pueden convertirse en cuatro y estas cuatro en ocho, y así sucesivamente.
Muchas bacterias son beneficiosas, algunas se utilizan en la elaboración de alimentos como la leche o el queso, en la obtención de medicamentos como antibióticos, e incluso para fabricar detergentes o curtir el cuero.
Las bacterias que viven en tu cuerpo ayudan a luchar contra las enfermedades, a digerir y absorber los alimentos o a producir vitaminas.
Algunas bacterias descomponen las plantas y los animales muertos o sus residuos. Los productos de esta descomposición enriquecen el suelo y son utilizados por las plantas como alimento. Algunas bacterias producen oxígeno, podemos incluso modificar algunas bacterias para conseguir medicamentos y vacunas; Pero otras bacterias son perjudiciales y producen enfermedades en las personas y en los animales, pueden contaminar los alimentos y producir intoxicaciones. A ellas se deben enfermedades tan conocidas como la tuberculosis, la peste, la sífilis, el tétano, el cólera y muchas formas de neumonía.
No todas las bacterias son iguales. Conocemos unas 1.600 especies de bacterias. Hay muchas formas de clasificarlas. Por su forma distinguimos cocos, bacilos, espirilos y vibrios.
• Los cocos son redondeados, como pequeñas esferas. A veces se juntan de dos en dos, otras veces forman cadenas que recuerdan las cuentas de un collar, y en otras ocasiones se unen formando racimos como los de las uvas; como los ESTREPTOCOCOS, redondos, en línea, los ESTAFILOCOCOS, redondos en cúmulos, los DIPLOCOCOS, redondos, en pares.
• Los bacilos son alargados, como si fueran diminutos bastoncillos.
• Los espirilos Están enrollados en espiral y pueden recordar a un muelle, a un tirabuzón o a un sacacorchos.
• Los vibrios tienen una forma curvada parecida a las comas que utilizamos para escribir.
Algunas especies de bacterias:
SARCINA
DIPLOBACILLUS
ESTREPTOBACILLUS
CORYNEFORMBACILLUS
SPIRILLUM
VIBRIO
SPIROCHETE
Las bacterias reaccionan por las pruebas de: Gram +, gram -, gram variable.
La respuesta de las células a la tinción se debe a las diferencias en complejidad y química de su pared celular, la cual contiene un polímetro llamado PEPTIDOGLUCANO.
La pared celular de las bacterias GRAM -, contienen menor cantidad de PEPTIDOGLUCANO, comparado con las bacterias GRAM +.
El empleo del calor para destruir las bacterias de la leche o de otros alimentos se llama pasteurización, en homenaje o LOUIS PASTEUR. El uso de temperaturas muy elevadas para matar las bacterias de los instrumentos que se utilizan en los quirófanos se llama esterilización.
Robert Koch. Este alemán realizó importantes descubrimientos sobre algunas bacterias y fundó LA BACTERIOLOGÍA un campo de la ciencia que se ocupa del estudio de las bacterias.
Microsoft Encarta 2009, diapositivas-las bacterias.
Sin embargo Carl Woese creó una nueva categoría taxonómica, por encima de la de reino, denominada dominio de seres vivos llamado Archaea, (arquebacterias) distinto de los dominios Bacteria (también agrupa organismos procariontes) y Eukarya (organismos eucariontes).
LAS BACTERIAS
Las bacterias son seres unicelulares, es decir que están formadas por una única célula. Esta célula está viva y por lo tanto crece, se alimenta, se reproduce y utiliza energía.
Las bacterias son células procariotas, es decir sin núcleo. Al no tener núcleo, el material genético flota en el citoplasma, algunas son autótrofas que producen su propio alimento, otras son heterótrofas que absorben nutrientes del medio ambiente alimentándose de restos de animales y vegetales carecen de organelos rodeados por membranas, con pared celular de peptidoglucano, DNA en forma de anillos- plásmidos, no tienen cromosomas.
Algunas bacterias tienen uno o varios flagelos, una especie de pelos especiales que permiten que la bacteria se mueva. Los flagelos ayudan a la bacteria a desplazarse en busca de alimento o a alejarse de las cosas que pueden hacerla daño, PILI: para el intercambio de material genético, CAPSULAS: para protegerse del medio ambiente, se reproducen por fisión binaria es decir, que en pocos minutos alargándose y dividiéndose por la mitad en dos. Estas dos bacterias pueden convertirse en cuatro y estas cuatro en ocho, y así sucesivamente.
Muchas bacterias son beneficiosas, algunas se utilizan en la elaboración de alimentos como la leche o el queso, en la obtención de medicamentos como antibióticos, e incluso para fabricar detergentes o curtir el cuero.
Las bacterias que viven en tu cuerpo ayudan a luchar contra las enfermedades, a digerir y absorber los alimentos o a producir vitaminas.
Algunas bacterias descomponen las plantas y los animales muertos o sus residuos. Los productos de esta descomposición enriquecen el suelo y son utilizados por las plantas como alimento. Algunas bacterias producen oxígeno, podemos incluso modificar algunas bacterias para conseguir medicamentos y vacunas; Pero otras bacterias son perjudiciales y producen enfermedades en las personas y en los animales, pueden contaminar los alimentos y producir intoxicaciones. A ellas se deben enfermedades tan conocidas como la tuberculosis, la peste, la sífilis, el tétano, el cólera y muchas formas de neumonía.
No todas las bacterias son iguales. Conocemos unas 1.600 especies de bacterias. Hay muchas formas de clasificarlas. Por su forma distinguimos cocos, bacilos, espirilos y vibrios.
• Los cocos son redondeados, como pequeñas esferas. A veces se juntan de dos en dos, otras veces forman cadenas que recuerdan las cuentas de un collar, y en otras ocasiones se unen formando racimos como los de las uvas; como los ESTREPTOCOCOS, redondos, en línea, los ESTAFILOCOCOS, redondos en cúmulos, los DIPLOCOCOS, redondos, en pares.
• Los bacilos son alargados, como si fueran diminutos bastoncillos.
• Los espirilos Están enrollados en espiral y pueden recordar a un muelle, a un tirabuzón o a un sacacorchos.
• Los vibrios tienen una forma curvada parecida a las comas que utilizamos para escribir.
Algunas especies de bacterias:
SARCINA
DIPLOBACILLUS
ESTREPTOBACILLUS
CORYNEFORMBACILLUS
SPIRILLUM
VIBRIO
SPIROCHETE
Las bacterias reaccionan por las pruebas de: Gram +, gram -, gram variable.
La respuesta de las células a la tinción se debe a las diferencias en complejidad y química de su pared celular, la cual contiene un polímetro llamado PEPTIDOGLUCANO.
La pared celular de las bacterias GRAM -, contienen menor cantidad de PEPTIDOGLUCANO, comparado con las bacterias GRAM +.
El empleo del calor para destruir las bacterias de la leche o de otros alimentos se llama pasteurización, en homenaje o LOUIS PASTEUR. El uso de temperaturas muy elevadas para matar las bacterias de los instrumentos que se utilizan en los quirófanos se llama esterilización.
Robert Koch. Este alemán realizó importantes descubrimientos sobre algunas bacterias y fundó LA BACTERIOLOGÍA un campo de la ciencia que se ocupa del estudio de las bacterias.
Microsoft Encarta 2009, diapositivas-las bacterias.
PRINCIPIOS BASICOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
PRINCIPIOS BASICOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
En 1920, según el premio Nobel H.J. Muller postulaba el material genético, debía de tener tres propiedades fundamentales.
• Tener capacidad de replicación.
• Codificar la información necesaria para producir los compuestos que determinan las características fenotípicas.
• Ser capaz de cambiar y de perpetuar esos cambios.
Veinte años más tarde se demostró que el ADN estaba hecho de unidades individuales llamadas nucleótidos, formados por una base nitrogenada (adenina –A–, guanina –G–, citosina–C– o timina –T–), un azúcar pentosa y ácido fosfórico.
Durante muchos años unos científicos postulaban que los genes eran ADN, otros argumentaban que era una estructura demasiado simple para la función tan compleja que se les asignaba. En 1952 cuando se obtuvo una prueba definitiva por A. Hershey y M. Chase. Utilizaron un bacteriófago para demostrar que sólo el ADN de este virus era capaz de entrar en la bacteria y producir nuevos virus, mientras que las proteínas formaban una estructura del ADN y eran eliminadas después de inyectar el ADN en las bacterias. Un año después, J. Watson y F. Crick descubrieron que el ADN consistía en dos largas cadenas de nucleótidos formando una doble hélice o espiral. Por ejemplo, el ADN del cromosoma 1 está constituido por una cadena de 263 millones de nucleótidos. El modelo de Watson y Crick predecía que cada cadena de ADN servia de molde para la producción de una nueva cadena, cuya secuencia de nucleótidos se determinaba por complementariedad de bases (adenina con Timina, y Guanina con Citosina).
La función real de los genes se demostró gracias a Neurospora de G. Beagle y E. Tatum, estos 2 investigadores desarrollaron la hipótesis “un gen-una enzima”, y es uno de los conceptos unificadores en Biología, que se ha mantenido vigente durante muchos años.
La secuencia de bases es la misma en todos los seres humanos, para el 99,9 % del ADN. Pero, ocasionalmente se encontraban POLIFORMISMOS: tramos cortos en los que la secuencia era distinta entre las personas y podían ser de varios tipos. Este concepto de los polimorfismos se convirtió en la base para trazar el mapa del genoma humano.
La invención de la reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR) inventada por K. Mullis en 1983, revolucionó la biología molecular. Esta metodología es capaz de amplificar un determinado fragmento de ADN millones de veces, lo que permite estudiar su secuencia con facilidad, el diagnóstico de enfermedades hereditarias, la detección de microorganismos patógenos o la identificación genética de muestras forenses.
En 1990 Watson en compañía de un grupo de científicos estadounidenses emprendió el proyecto “Genoma Humano” el cual pretendía en un periodo de 15 años descifrar la secuencia completa del genoma, (la secuencia completa de 3.000 millones de bases) al poco tiempo otros países se unieron a esta investigación
En abril de 2003, se presentó una nueva versión que incluía el 99 % de la secuencia del genoma que contiene los genes, con una fiabilidad del 99,99%4.
POLIFORMISMOS DE UN NUCLEÓTIDO
Los SNP son variaciones en la secuencia de ADN que afectan a una sola base (A, T, G o C). Para que una variación genética sea considerada un SNP, ha de encontrarse al menos en el 1% de la población.
Características:
• Representan el 90 % de todas las variaciones genéticas.
• Se encuentra un SNP cada 100-300 bases.
• Dos de cada tres SNP son cambios de C por T.
• Pueden darse tanto en regiones codificantes como no codificantes del genoma.
• Son relativamente estables de generación en generación.
El médico Sir William Osler escribió en 1892: “Si no fuera por la gran variabilidad entre individuos, la medicina sería una ciencia y no un arte”. Más de un siglo después, el análisis de SNP explica esta variabilidad y proporciona la base para desarrollar tratamientos específicos para cada paciente.
Muchos SNP no tienen efecto sobre las funciones celulares, pero otros predisponen a ciertas enfermedades o modifican la respuesta a agresiones ambientales, infecciones o farmacéuticos.
Diversos grupos trabajan en la creación de un mapa de haplotipos o HapMap), en el genoma humano lo que puede ayudar a identificar los múltiples genes asociados a enfermedades como el cáncer, la diabetes, la artritis reumatoide.
Un haplotipo es un conjunto de SNP “vecinos” localizados en el mismo cromosoma y que son heredados en bloque, lo que permite identificar a uno de esos SNP (al que denominamos tag SNP) como representativo de un determinado
haplotipo. Una vez identificado el haplotipo, se puede determinar qué SNP y qué gen están asociados a un determinado fenotipo.
Uno de los genes asociados a la enfermedad de Alzheimer, la apolipoproteína E, es un buen ejemplo de ello. Este gen tiene 2 SNP que dan lugar a tres posibles alelos (variantes de un gen): E2, E3 y E4. Cada alelo difiere en una sola base, y las proteínas resultantes difieren en un aminoácido, siendo este cambio suficiente para alterar la función de la proteína. Se ha demostrado que un individuo que hereda al menos un alelo E4 tendrá una mayor probabilidad de desarrollar la enfermedad.
Los SNP también pueden condicionar la respuesta a los tratamientos. Este es el caso de los polimorfismos asociados al gen de la tiopurina S-metil-transferasa (TPMT) y su influencia en la respuesta a mercaptopurina y azatiopurina en pacientes que heredan los alelos no funcionales de la enzima7. Estos fármacos se utilizan como inmunosupresores y antitumorales, y en ausencia de TPMT se acumulan los nucleótidos de tioguanina en las células sanguíneas, lo que puede ocasionar una hematotoxicidad grave. Los pacientes portadores del polimorfismo inactivante de la enzima pueden ser tratados con éxito utilizando dosis menores de tiopurina.
En esta intersección de genómica y medicina se sitúa la farmacogenómica, cuyo objetivo es definir los determinantes genéticos de respuesta a los medicamentos.
Hoy día se utilizan diferentes técnicas para realizar análisis de un gran número de SNP. La espectrometría de masas.
EXPRESIÓN GENICA
Un gen es una secuencia específica de bases que sirve de molde para la síntesis de un ARN mensajero. La secuencia de este ARNm es leída por una compleja maquinaria de “traducción” que asocia bloques de tres bases (codones) con aminoácidos mediante el denominado código genético. La mayoría de los genes están compuestos por un conjunto de regiones codificantes (exones) separadas por regiones no codificantes (intrones). Las secuencias que corresponden a intrones son eliminadas enzimáticamente y los exones se unen entre sí para formar un ARNm maduro y funcional.
Este proceso, denominado “ARNm splicing” o procesamiento alternativo del ARNm, posibilita que un gen sea capaz de generar diferentes proteínas,
En los últimos años, se ha desarrollado una nueva tecnología denominada biochip, genechip, chip de ADN o microarray de ADN, la cual permite analizar la expresión de todos los genes del genoma humano de forma simultánea. Un array es una disposición ordenada de muestras, en este caso fragmentos de ADN (sondas).
Los genechips están teniendo un gran impacto en farmacogenómica (correlación entre respuesta a fármacos y perfil genético del paciente), y en estudios toxicológicos (correlación entre la respuesta a productos tóxicos y los cambios en los niveles de expresión génica).
En los últimos años se han analizado los perfiles de expresión de miles de muestras obtenidas de pacientes con distintas patologías, especialmente cáncer, y cientos de patrones de expresión génica o “firmas genéticas” se han asociado con la progresión de la enfermedad, el pronóstico y la respuesta al tratamiento. Uno de Los primero trabajos fue el de un grupo del Instituto Holandés del Cáncer, que publicó un perfil de expresión de 70 genes en muestras de tejido tumoral que predecía la evolución de los pacientes con cáncer de mama. De esta manera, se definía un grupo de pacientes con “firma” genética de buen pronóstico (supervivencia a 10 años del 94,5%) y otro con “firma” genética de mal pronóstico (supervivencia a 10 años del 50,6 %).
En 1920, según el premio Nobel H.J. Muller postulaba el material genético, debía de tener tres propiedades fundamentales.
• Tener capacidad de replicación.
• Codificar la información necesaria para producir los compuestos que determinan las características fenotípicas.
• Ser capaz de cambiar y de perpetuar esos cambios.
Veinte años más tarde se demostró que el ADN estaba hecho de unidades individuales llamadas nucleótidos, formados por una base nitrogenada (adenina –A–, guanina –G–, citosina–C– o timina –T–), un azúcar pentosa y ácido fosfórico.
Durante muchos años unos científicos postulaban que los genes eran ADN, otros argumentaban que era una estructura demasiado simple para la función tan compleja que se les asignaba. En 1952 cuando se obtuvo una prueba definitiva por A. Hershey y M. Chase. Utilizaron un bacteriófago para demostrar que sólo el ADN de este virus era capaz de entrar en la bacteria y producir nuevos virus, mientras que las proteínas formaban una estructura del ADN y eran eliminadas después de inyectar el ADN en las bacterias. Un año después, J. Watson y F. Crick descubrieron que el ADN consistía en dos largas cadenas de nucleótidos formando una doble hélice o espiral. Por ejemplo, el ADN del cromosoma 1 está constituido por una cadena de 263 millones de nucleótidos. El modelo de Watson y Crick predecía que cada cadena de ADN servia de molde para la producción de una nueva cadena, cuya secuencia de nucleótidos se determinaba por complementariedad de bases (adenina con Timina, y Guanina con Citosina).
La función real de los genes se demostró gracias a Neurospora de G. Beagle y E. Tatum, estos 2 investigadores desarrollaron la hipótesis “un gen-una enzima”, y es uno de los conceptos unificadores en Biología, que se ha mantenido vigente durante muchos años.
La secuencia de bases es la misma en todos los seres humanos, para el 99,9 % del ADN. Pero, ocasionalmente se encontraban POLIFORMISMOS: tramos cortos en los que la secuencia era distinta entre las personas y podían ser de varios tipos. Este concepto de los polimorfismos se convirtió en la base para trazar el mapa del genoma humano.
La invención de la reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR) inventada por K. Mullis en 1983, revolucionó la biología molecular. Esta metodología es capaz de amplificar un determinado fragmento de ADN millones de veces, lo que permite estudiar su secuencia con facilidad, el diagnóstico de enfermedades hereditarias, la detección de microorganismos patógenos o la identificación genética de muestras forenses.
En 1990 Watson en compañía de un grupo de científicos estadounidenses emprendió el proyecto “Genoma Humano” el cual pretendía en un periodo de 15 años descifrar la secuencia completa del genoma, (la secuencia completa de 3.000 millones de bases) al poco tiempo otros países se unieron a esta investigación
En abril de 2003, se presentó una nueva versión que incluía el 99 % de la secuencia del genoma que contiene los genes, con una fiabilidad del 99,99%4.
POLIFORMISMOS DE UN NUCLEÓTIDO
Los SNP son variaciones en la secuencia de ADN que afectan a una sola base (A, T, G o C). Para que una variación genética sea considerada un SNP, ha de encontrarse al menos en el 1% de la población.
Características:
• Representan el 90 % de todas las variaciones genéticas.
• Se encuentra un SNP cada 100-300 bases.
• Dos de cada tres SNP son cambios de C por T.
• Pueden darse tanto en regiones codificantes como no codificantes del genoma.
• Son relativamente estables de generación en generación.
El médico Sir William Osler escribió en 1892: “Si no fuera por la gran variabilidad entre individuos, la medicina sería una ciencia y no un arte”. Más de un siglo después, el análisis de SNP explica esta variabilidad y proporciona la base para desarrollar tratamientos específicos para cada paciente.
Muchos SNP no tienen efecto sobre las funciones celulares, pero otros predisponen a ciertas enfermedades o modifican la respuesta a agresiones ambientales, infecciones o farmacéuticos.
Diversos grupos trabajan en la creación de un mapa de haplotipos o HapMap), en el genoma humano lo que puede ayudar a identificar los múltiples genes asociados a enfermedades como el cáncer, la diabetes, la artritis reumatoide.
Un haplotipo es un conjunto de SNP “vecinos” localizados en el mismo cromosoma y que son heredados en bloque, lo que permite identificar a uno de esos SNP (al que denominamos tag SNP) como representativo de un determinado
haplotipo. Una vez identificado el haplotipo, se puede determinar qué SNP y qué gen están asociados a un determinado fenotipo.
Uno de los genes asociados a la enfermedad de Alzheimer, la apolipoproteína E, es un buen ejemplo de ello. Este gen tiene 2 SNP que dan lugar a tres posibles alelos (variantes de un gen): E2, E3 y E4. Cada alelo difiere en una sola base, y las proteínas resultantes difieren en un aminoácido, siendo este cambio suficiente para alterar la función de la proteína. Se ha demostrado que un individuo que hereda al menos un alelo E4 tendrá una mayor probabilidad de desarrollar la enfermedad.
Los SNP también pueden condicionar la respuesta a los tratamientos. Este es el caso de los polimorfismos asociados al gen de la tiopurina S-metil-transferasa (TPMT) y su influencia en la respuesta a mercaptopurina y azatiopurina en pacientes que heredan los alelos no funcionales de la enzima7. Estos fármacos se utilizan como inmunosupresores y antitumorales, y en ausencia de TPMT se acumulan los nucleótidos de tioguanina en las células sanguíneas, lo que puede ocasionar una hematotoxicidad grave. Los pacientes portadores del polimorfismo inactivante de la enzima pueden ser tratados con éxito utilizando dosis menores de tiopurina.
En esta intersección de genómica y medicina se sitúa la farmacogenómica, cuyo objetivo es definir los determinantes genéticos de respuesta a los medicamentos.
Hoy día se utilizan diferentes técnicas para realizar análisis de un gran número de SNP. La espectrometría de masas.
EXPRESIÓN GENICA
Un gen es una secuencia específica de bases que sirve de molde para la síntesis de un ARN mensajero. La secuencia de este ARNm es leída por una compleja maquinaria de “traducción” que asocia bloques de tres bases (codones) con aminoácidos mediante el denominado código genético. La mayoría de los genes están compuestos por un conjunto de regiones codificantes (exones) separadas por regiones no codificantes (intrones). Las secuencias que corresponden a intrones son eliminadas enzimáticamente y los exones se unen entre sí para formar un ARNm maduro y funcional.
Este proceso, denominado “ARNm splicing” o procesamiento alternativo del ARNm, posibilita que un gen sea capaz de generar diferentes proteínas,
En los últimos años, se ha desarrollado una nueva tecnología denominada biochip, genechip, chip de ADN o microarray de ADN, la cual permite analizar la expresión de todos los genes del genoma humano de forma simultánea. Un array es una disposición ordenada de muestras, en este caso fragmentos de ADN (sondas).
Los genechips están teniendo un gran impacto en farmacogenómica (correlación entre respuesta a fármacos y perfil genético del paciente), y en estudios toxicológicos (correlación entre la respuesta a productos tóxicos y los cambios en los niveles de expresión génica).
En los últimos años se han analizado los perfiles de expresión de miles de muestras obtenidas de pacientes con distintas patologías, especialmente cáncer, y cientos de patrones de expresión génica o “firmas genéticas” se han asociado con la progresión de la enfermedad, el pronóstico y la respuesta al tratamiento. Uno de Los primero trabajos fue el de un grupo del Instituto Holandés del Cáncer, que publicó un perfil de expresión de 70 genes en muestras de tejido tumoral que predecía la evolución de los pacientes con cáncer de mama. De esta manera, se definía un grupo de pacientes con “firma” genética de buen pronóstico (supervivencia a 10 años del 94,5%) y otro con “firma” genética de mal pronóstico (supervivencia a 10 años del 50,6 %).
TINCION DE GRAM
TINCION DE GRAM
El tamaño de las bacterias y otros microorganismos dificulta observarlas en detalle con el microscopio óptico por causa de la falta de contraste que existe entre estos, debido a que son usualmente transparente en el medio que les rodea; hizo que se crearan métodos para poder apreciarlas, siendo “los métodos más sencillos el de fijación y tinción, iniciados por Paul Ehrlich y Robert Koch, así el uso de colorantes, es el medio más simple de aumentar el contraste. Estos pueden utilizarse para distinguir o apreciar la presencia de algunos elementos celulares, como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, mitocondrias, núcleos, membranas celulares, etc.
Los colorantes que se utilizan usualmente son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con los componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleícos y los polisacáridos (azul de metileno, el cristal violeta y la safranina); otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) los que se combinan con elementos celulares cargados positivamente, como las proteínas (Eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo). Existe otro grupo de colorantes conformado por sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose para localizar los depósitos de grasa.
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes. Su aplicación práctica es innegable sobre todo en el trabajo microscópico de rutina; las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, espirilos, negativos y positivos) se basan precisamente en la tinción de GRAM*
Esta técnica de coloración de contraste fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884, la reacción de Gram puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio. La capacidad de las células para captar la coloración Gram solo es aplicable en bacterias, el fundamento de la técnica se hace con base en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas, posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácido teicoico. Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el acodo lipòteicoico y en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano. Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglucano unida a una membrana exterior por lipoproteínas La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido (que se encuentra en la cara externa de la membrana externa de este tipo de bacterias).
El peptidoglucano es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen de manera distinta debido a estas diferencias de su pared.
La diferencia en la resistencia a la decoloración, es debido a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglucano, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.
En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita
Un microorganismo grampositivo debe presentar una pared celular sana, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gramnegativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante.
Varias son las teorías para explicar el mecanismo de la tinción de Gram:
* Stearn y Stearn (1923) establecen que es una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, ambos investigadores comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y los básicos en medio alcalinos. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. Como los microbios contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según estos investigadores, los gérmenes grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los gérmenes gramnegativos; y, a base de sus experimentos deducen las siguientes conclusiones:
1. Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
2. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.
3. Los microbios de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad.
4. Los microbios de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.
5. En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.
6. Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.
7. La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microbios gramnegativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes; su efecto, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.
8. El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo.
*Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos correspondían a periodos de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reacción.
*Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo.
*Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reacción grampositiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular, sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los gérmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram.
*La pared celular de las bacterias grampositivas y gramnegativas es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de las primeras no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva consiste en la formación, dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de las bacterias grampositivas, a diferencia de la de las gramnegativas, sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo.
*Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración.
Las bacterias resistentes a la tinción Gram son Mycobacterias, Micoplasmas, formas L, Protoplasmas y esferoplastos
El primer paso en cualquier tinción debe ser siempre la fijación con calor. Posteriormente el cristal violeta penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas).
El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo yodo/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. La función del alcohol-acetona es la quitar el colorante de las bacterias, así si la bacteria conserva el tinte, es Gram positiva y si el tinte no se mantiene es Gram negativa.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina no es crucial para la técnica por lo que puede o no utilizarse. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas.
Al término de la tinción, las Gram positivas se verán azúl-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina)
Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos metilo contenido. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el colorante primario mejor para teñir por el método de Gram.
USOS: En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:
- Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.
- Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. (Los morfotipos de los microorganismos identificados en la tinción de Gram deben corresponder con los aislamientos de bacterias realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como el ambiente de incubación.)
- Importancia de la calidad de la muestra biológica para el estudio, se valora con esto, el número de células inflamatorias (a mayor número de células inflamatorias más probabilidad de que la flora sea representativa del lugar de la infección) así como de células epiteliales (es mayor la probabilidad de contaminación de flora saprófita que no es representativa del lugar de la infección)
A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varias formas distintas:
- Los cocos de forma esférica. Pueden presentarse aislados después de la división celular (Micrococos), por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).
- Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.
- También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas, si poseen forma de “coma”, - curvados, entonces se les llama vibriones.
TECNICA DE LA COLORACION GRAM
- Recoger muestra estéril
- Hacer el extendido en espiral
- Dejar secar a temperatura ambiente
- Fijar la muestra al calor (flamenado 3 veces aprox.)
- Agregar cristal violeta al y esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color morado las bacterias Gram positivas.
- Enjuagar con agua corriente. *
- Agregar yodo y esperar 1 minuto.
- Enjuagar con agua corriente .
- Agregar alcohol y acetona por goteo y esperar 15 segundos.
- Enjuagar con agua.
- Agregar safranina y esperar 30 segundos. Este tinte dejará de color rosado las bacterias Gram negativas.
- Enjuagar con agua.
- Chorro suave ya sea con pileta o directo de la llave
- Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión
BIBLIOGRAFIA
• Garrido Farña Germán Isauro, Miguel Angel Cornejo Cortes y Elsa Salinas Jiménez, 2003 “Manual de colorantes para laboratorios de Ciencias biológicas” UNAM México 95 pp.
• Forbes, B.A., Sahm D. F. Weissfeld A.S. 1993 Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology. 506 pp.
• Schlegel, H. G.. 1997. “Microbiología general” 9. ed. Barcelona : Omega, 654pp.
• Bailey-Scott 1985 Diagnostic Microbiology
• fai.unne.edu.ar/.../micro-ianez/03_micro.htm Curso de Microbiología General de Enrique Iáñez Actualizado el 17 de agosto de 1998 consultado en agosto de 2006
• http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:Mycobacterial_cell_wall_diagram.png
• http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidoglucano y Schlegel, 1997. “Microbiología general”
• http://www.nupedia.com/newsystem/upload_file/830/bilayer_micelle.png
El tamaño de las bacterias y otros microorganismos dificulta observarlas en detalle con el microscopio óptico por causa de la falta de contraste que existe entre estos, debido a que son usualmente transparente en el medio que les rodea; hizo que se crearan métodos para poder apreciarlas, siendo “los métodos más sencillos el de fijación y tinción, iniciados por Paul Ehrlich y Robert Koch, así el uso de colorantes, es el medio más simple de aumentar el contraste. Estos pueden utilizarse para distinguir o apreciar la presencia de algunos elementos celulares, como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, mitocondrias, núcleos, membranas celulares, etc.
Los colorantes que se utilizan usualmente son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con los componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleícos y los polisacáridos (azul de metileno, el cristal violeta y la safranina); otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) los que se combinan con elementos celulares cargados positivamente, como las proteínas (Eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo). Existe otro grupo de colorantes conformado por sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose para localizar los depósitos de grasa.
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes. Su aplicación práctica es innegable sobre todo en el trabajo microscópico de rutina; las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, espirilos, negativos y positivos) se basan precisamente en la tinción de GRAM*
Esta técnica de coloración de contraste fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884, la reacción de Gram puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio. La capacidad de las células para captar la coloración Gram solo es aplicable en bacterias, el fundamento de la técnica se hace con base en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas, posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácido teicoico. Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el acodo lipòteicoico y en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano. Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglucano unida a una membrana exterior por lipoproteínas La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido (que se encuentra en la cara externa de la membrana externa de este tipo de bacterias).
El peptidoglucano es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen de manera distinta debido a estas diferencias de su pared.
La diferencia en la resistencia a la decoloración, es debido a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglucano, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.
En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita
Un microorganismo grampositivo debe presentar una pared celular sana, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gramnegativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante.
Varias son las teorías para explicar el mecanismo de la tinción de Gram:
* Stearn y Stearn (1923) establecen que es una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, ambos investigadores comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y los básicos en medio alcalinos. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. Como los microbios contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según estos investigadores, los gérmenes grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los gérmenes gramnegativos; y, a base de sus experimentos deducen las siguientes conclusiones:
1. Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
2. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.
3. Los microbios de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad.
4. Los microbios de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.
5. En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.
6. Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.
7. La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microbios gramnegativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes; su efecto, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.
8. El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo.
*Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos correspondían a periodos de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reacción.
*Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo.
*Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reacción grampositiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular, sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los gérmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram.
*La pared celular de las bacterias grampositivas y gramnegativas es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de las primeras no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva consiste en la formación, dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de las bacterias grampositivas, a diferencia de la de las gramnegativas, sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo.
*Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración.
Las bacterias resistentes a la tinción Gram son Mycobacterias, Micoplasmas, formas L, Protoplasmas y esferoplastos
El primer paso en cualquier tinción debe ser siempre la fijación con calor. Posteriormente el cristal violeta penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas).
El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo yodo/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. La función del alcohol-acetona es la quitar el colorante de las bacterias, así si la bacteria conserva el tinte, es Gram positiva y si el tinte no se mantiene es Gram negativa.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina no es crucial para la técnica por lo que puede o no utilizarse. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas.
Al término de la tinción, las Gram positivas se verán azúl-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina)
Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos metilo contenido. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el colorante primario mejor para teñir por el método de Gram.
USOS: En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:
- Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.
- Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. (Los morfotipos de los microorganismos identificados en la tinción de Gram deben corresponder con los aislamientos de bacterias realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como el ambiente de incubación.)
- Importancia de la calidad de la muestra biológica para el estudio, se valora con esto, el número de células inflamatorias (a mayor número de células inflamatorias más probabilidad de que la flora sea representativa del lugar de la infección) así como de células epiteliales (es mayor la probabilidad de contaminación de flora saprófita que no es representativa del lugar de la infección)
A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varias formas distintas:
- Los cocos de forma esférica. Pueden presentarse aislados después de la división celular (Micrococos), por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).
- Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.
- También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas, si poseen forma de “coma”, - curvados, entonces se les llama vibriones.
TECNICA DE LA COLORACION GRAM
- Recoger muestra estéril
- Hacer el extendido en espiral
- Dejar secar a temperatura ambiente
- Fijar la muestra al calor (flamenado 3 veces aprox.)
- Agregar cristal violeta al y esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color morado las bacterias Gram positivas.
- Enjuagar con agua corriente. *
- Agregar yodo y esperar 1 minuto.
- Enjuagar con agua corriente .
- Agregar alcohol y acetona por goteo y esperar 15 segundos.
- Enjuagar con agua.
- Agregar safranina y esperar 30 segundos. Este tinte dejará de color rosado las bacterias Gram negativas.
- Enjuagar con agua.
- Chorro suave ya sea con pileta o directo de la llave
- Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión
BIBLIOGRAFIA
• Garrido Farña Germán Isauro, Miguel Angel Cornejo Cortes y Elsa Salinas Jiménez, 2003 “Manual de colorantes para laboratorios de Ciencias biológicas” UNAM México 95 pp.
• Forbes, B.A., Sahm D. F. Weissfeld A.S. 1993 Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology. 506 pp.
• Schlegel, H. G.. 1997. “Microbiología general” 9. ed. Barcelona : Omega, 654pp.
• Bailey-Scott 1985 Diagnostic Microbiology
• fai.unne.edu.ar/.../micro-ianez/03_micro.htm Curso de Microbiología General de Enrique Iáñez Actualizado el 17 de agosto de 1998 consultado en agosto de 2006
• http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:Mycobacterial_cell_wall_diagram.png
• http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidoglucano y Schlegel, 1997. “Microbiología general”
• http://www.nupedia.com/newsystem/upload_file/830/bilayer_micelle.png
martes, 15 de septiembre de 2009
ULTRA ESTRUCTURA CELULAR
ULTRA ESTRUCTURA CELULAR
JENNY FARLEY QUINTERO
QUE ES MICROBIOLOGIA?
Ciencia que trata de los seres vivos muy pequeños: aquellos cuyo tamaño se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano: los microbios
MICROORGANISMOS:
Conjunto de formas de vida agrupados por conveniencia del hombre, todos los organismos que no se pueden ver a simple vista. Este grupo es muy heterogéneo no pertenecen al mismo reino.
Como funcionan (fisiología)
Reproducción (dinámica)
CIENCIA:
· Objeto de estudio
· Paradigmas
· verdades
· historia
· modelo de coherencia.
JENNER: Descubrió que la viruela se transmitía por medio del estiércol de la vaca, e invento la vacuna contra ella.
Virchow, patólogo alemán fue un contrincante de Pasteur ya que este tenía la teoría de que las enfermedades eran causadas por microbios. A Virchow esto no le parecía correcto. También porfiaba con Metchnikov sobre su teoría acerca de la migración de leucocitos. Lo logro reproducir en cultivos asilados y luego reproducir la enfermedad en animales de laboratorio. Con esta información rigurosamente asentada hizo la presentación en sociedad de su descubrimiento, esto fue demasiado para Virchow considerado uno de los genios de su época que según algunas fuentes dejo la medicina y se dedico a la arqueología.
LA MORFOLOGIA
En biología. Se refiere al estudio de las formas externas e internas y de la estructura de los seres orgánicos, sus transformaciones y las causas y leyes que las determinan.
Demostró que las bacterias no andaban solas y llamaron a las que se agrupaban estreptococo. Las bacterias viven en colonias que aunque son independientes cada una actúan en grupo
PROTEINAS: moléculas son aminoácidos, que cumple una función específica.
LA MEMBRANA CELULAR: tiene una característica básica, tiene una vi capa lipidica, los lípidos tienen una cabeza hidrofobica, y cola hidrofilica.
MEMBRANA CELULAR:
1. da la forma a la célula,
2. es un medio selectivo (portera),
3. es emisora de señales,
4. recepción de señales altamente codificadas.
5. Es productora de señales químicas
PRIMERA GENERACION: abre poros
SEGUNDA GENERACION: para la respiración
TERCERA GENERACION: interrumpe el ciclo celular
CUARTA GENERACION: interrumpe la función de las proteínas.
RIBOSOMA:. Los ribosomas tienen forma redondeada y son los encargados de fabricar proteínas. Hay muchos ribosomas en el citoplasma de la célula.
MITOCONDRIA: Las mitocondrias son unos orgánulos alargados que se encargan de producir energía. Están envueltas por dos membranas: la membrana externa es lisa y la interna tiene unos pliegues que reciben el nombre de crestas.
APARATO DE GOLGI: El aparato de Golgi es un orgánulo celular que interviene en la producción, almacenamiento y transporte de algunas sustancias.
RETICULO ENDOPLASMATICO: El retículo endoplasmático está formado por una especie de saquitos situados a lo largo del citoplasma. Se encarga de fabricar y almacenar algunas sustancias que la célula necesita. También conecta la membrana nuclear con la membrana plasmática. A veces, el retículo endoplasmático lleva pegados varios ribosomas y recibe el nombre de retículo endoplasmático rugoso.
Se presenta como una serie de casos o bolsas aplanadas y túbulos membranosos, cuya localización y extensión es variable, y depende de la actividad metabólica particular de la célula.
UNA BACTERIA ES: una célula con metabolismo completo
Las bacterias son seres unicelulares, lo que quiere decir que están formadas por una única célula. Esta célula está viva y por lo tanto crece, se alimenta y utiliza energía, se reproduce y se relaciona con el medio en el que vive.
LOS VIRUS: Los virus son unos organismos un poco especiales. No son seres vivos porque no son capaces de realizar la mayoría de estas funciones. Sin embargo, sí son capaces de reproducirse y para ello, necesitan invadir las células de los seres vivos.
Los virus pueden invadir un ser vivo y multiplicarse dentro de él, es decir pueden infectarlo. Cada virus infecta solo a un tipo determinado de células.
BIBLIOGRAFIA: Mi Primera Encarta 2009
JENNY FARLEY QUINTERO
QUE ES MICROBIOLOGIA?
Ciencia que trata de los seres vivos muy pequeños: aquellos cuyo tamaño se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano: los microbios
MICROORGANISMOS:
Conjunto de formas de vida agrupados por conveniencia del hombre, todos los organismos que no se pueden ver a simple vista. Este grupo es muy heterogéneo no pertenecen al mismo reino.
Como funcionan (fisiología)
Reproducción (dinámica)
CIENCIA:
· Objeto de estudio
· Paradigmas
· verdades
· historia
· modelo de coherencia.
JENNER: Descubrió que la viruela se transmitía por medio del estiércol de la vaca, e invento la vacuna contra ella.
Virchow, patólogo alemán fue un contrincante de Pasteur ya que este tenía la teoría de que las enfermedades eran causadas por microbios. A Virchow esto no le parecía correcto. También porfiaba con Metchnikov sobre su teoría acerca de la migración de leucocitos. Lo logro reproducir en cultivos asilados y luego reproducir la enfermedad en animales de laboratorio. Con esta información rigurosamente asentada hizo la presentación en sociedad de su descubrimiento, esto fue demasiado para Virchow considerado uno de los genios de su época que según algunas fuentes dejo la medicina y se dedico a la arqueología.
LA MORFOLOGIA
En biología. Se refiere al estudio de las formas externas e internas y de la estructura de los seres orgánicos, sus transformaciones y las causas y leyes que las determinan.
Demostró que las bacterias no andaban solas y llamaron a las que se agrupaban estreptococo. Las bacterias viven en colonias que aunque son independientes cada una actúan en grupo
PROTEINAS: moléculas son aminoácidos, que cumple una función específica.
LA MEMBRANA CELULAR: tiene una característica básica, tiene una vi capa lipidica, los lípidos tienen una cabeza hidrofobica, y cola hidrofilica.
MEMBRANA CELULAR:
1. da la forma a la célula,
2. es un medio selectivo (portera),
3. es emisora de señales,
4. recepción de señales altamente codificadas.
5. Es productora de señales químicas
PRIMERA GENERACION: abre poros
SEGUNDA GENERACION: para la respiración
TERCERA GENERACION: interrumpe el ciclo celular
CUARTA GENERACION: interrumpe la función de las proteínas.
RIBOSOMA:. Los ribosomas tienen forma redondeada y son los encargados de fabricar proteínas. Hay muchos ribosomas en el citoplasma de la célula.
MITOCONDRIA: Las mitocondrias son unos orgánulos alargados que se encargan de producir energía. Están envueltas por dos membranas: la membrana externa es lisa y la interna tiene unos pliegues que reciben el nombre de crestas.
APARATO DE GOLGI: El aparato de Golgi es un orgánulo celular que interviene en la producción, almacenamiento y transporte de algunas sustancias.
RETICULO ENDOPLASMATICO: El retículo endoplasmático está formado por una especie de saquitos situados a lo largo del citoplasma. Se encarga de fabricar y almacenar algunas sustancias que la célula necesita. También conecta la membrana nuclear con la membrana plasmática. A veces, el retículo endoplasmático lleva pegados varios ribosomas y recibe el nombre de retículo endoplasmático rugoso.
Se presenta como una serie de casos o bolsas aplanadas y túbulos membranosos, cuya localización y extensión es variable, y depende de la actividad metabólica particular de la célula.
UNA BACTERIA ES: una célula con metabolismo completo
Las bacterias son seres unicelulares, lo que quiere decir que están formadas por una única célula. Esta célula está viva y por lo tanto crece, se alimenta y utiliza energía, se reproduce y se relaciona con el medio en el que vive.
LOS VIRUS: Los virus son unos organismos un poco especiales. No son seres vivos porque no son capaces de realizar la mayoría de estas funciones. Sin embargo, sí son capaces de reproducirse y para ello, necesitan invadir las células de los seres vivos.
Los virus pueden invadir un ser vivo y multiplicarse dentro de él, es decir pueden infectarlo. Cada virus infecta solo a un tipo determinado de células.
BIBLIOGRAFIA: Mi Primera Encarta 2009
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