jueves, 1 de octubre de 2009

TINCION DE GRAM

TINCION DE GRAM
El tamaño de las bacterias y otros microorganismos dificulta observarlas en detalle con el microscopio óptico por causa de la falta de contraste que existe entre estos, debido a que son usualmente transparente en el medio que les rodea; hizo que se crearan métodos para poder apreciarlas, siendo “los métodos más sencillos el de fijación y tinción, iniciados por Paul Ehrlich y Robert Koch, así el uso de colorantes, es el medio más simple de aumentar el contraste. Estos pueden utilizarse para distinguir o apreciar la presencia de algunos elementos celulares, como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, mitocondrias, núcleos, membranas celulares, etc.
Los colorantes que se utilizan usualmente son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con los componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleícos y los polisacáridos (azul de metileno, el cristal violeta y la safranina); otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) los que se combinan con elementos celulares cargados positivamente, como las proteínas (Eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo). Existe otro grupo de colorantes conformado por sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose para localizar los depósitos de grasa.

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes. Su aplicación práctica es innegable sobre todo en el trabajo microscópico de rutina; las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, espirilos, negativos y positivos) se basan precisamente en la tinción de GRAM*

Esta técnica de coloración de contraste fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884, la reacción de Gram puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio. La capacidad de las células para captar la coloración Gram solo es aplicable en bacterias, el fundamento de la técnica se hace con base en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas, posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácido teicoico. Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el acodo lipòteicoico y en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano. Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglucano unida a una membrana exterior por lipoproteínas La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido (que se encuentra en la cara externa de la membrana externa de este tipo de bacterias).

El peptidoglucano es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen de manera distinta debido a estas diferencias de su pared.
La diferencia en la resistencia a la decoloración, es debido a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglucano, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita

Un microorganismo grampositivo debe presentar una pared celular sana, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gramnegativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante.
Varias son las teorías para explicar el mecanismo de la tinción de Gram:
* Stearn y Stearn (1923) establecen que es una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, ambos investigadores comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y los básicos en medio alcalinos. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. Como los microbios contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según estos investigadores, los gérmenes grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los gérmenes gramnegativos; y, a base de sus experimentos deducen las siguientes conclusiones:
1. Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
2. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.
3. Los microbios de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad.
4. Los microbios de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.
5. En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.
6. Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.
7. La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microbios gramnegativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes; su efecto, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.
8. El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo.

*Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos correspondían a periodos de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reacción.

*Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo.

*Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reacción grampositiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular, sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los gérmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram.

*La pared celular de las bacterias grampositivas y gramnegativas es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de las primeras no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva consiste en la formación, dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de las bacterias grampositivas, a diferencia de la de las gramnegativas, sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo.


*Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración.

Las bacterias resistentes a la tinción Gram son Mycobacterias, Micoplasmas, formas L, Protoplasmas y esferoplastos

El primer paso en cualquier tinción debe ser siempre la fijación con calor. Posteriormente el cristal violeta penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas).
El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo. El yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo yodo/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. La función del alcohol-acetona es la quitar el colorante de las bacterias, así si la bacteria conserva el tinte, es Gram positiva y si el tinte no se mantiene es Gram negativa.

Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina no es crucial para la técnica por lo que puede o no utilizarse. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas.
Al término de la tinción, las Gram positivas se verán azúl-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina)
Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos metilo contenido. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el colorante primario mejor para teñir por el método de Gram.



USOS: En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:

- Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.
- Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. (Los morfotipos de los microorganismos identificados en la tinción de Gram deben corresponder con los aislamientos de bacterias realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como el ambiente de incubación.)
- Importancia de la calidad de la muestra biológica para el estudio, se valora con esto, el número de células inflamatorias (a mayor número de células inflamatorias más probabilidad de que la flora sea representativa del lugar de la infección) así como de células epiteliales (es mayor la probabilidad de contaminación de flora saprófita que no es representativa del lugar de la infección)

A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varias formas distintas:
- Los cocos de forma esférica. Pueden presentarse aislados después de la división celular (Micrococos), por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).
- Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.
- También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas, si poseen forma de “coma”, - curvados, entonces se les llama vibriones.

TECNICA DE LA COLORACION GRAM
- Recoger muestra estéril
- Hacer el extendido en espiral
- Dejar secar a temperatura ambiente
- Fijar la muestra al calor (flamenado 3 veces aprox.)
- Agregar cristal violeta al y esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color morado las bacterias Gram positivas.
- Enjuagar con agua corriente. *
- Agregar yodo y esperar 1 minuto.
- Enjuagar con agua corriente .
- Agregar alcohol y acetona por goteo y esperar 15 segundos.
- Enjuagar con agua.
- Agregar safranina y esperar 30 segundos. Este tinte dejará de color rosado las bacterias Gram negativas.
- Enjuagar con agua.
- Chorro suave ya sea con pileta o directo de la llave
- Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión


BIBLIOGRAFIA
• Garrido Farña Germán Isauro, Miguel Angel Cornejo Cortes y Elsa Salinas Jiménez, 2003 “Manual de colorantes para laboratorios de Ciencias biológicas” UNAM México 95 pp.
• Forbes, B.A., Sahm D. F. Weissfeld A.S. 1993 Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology. 506 pp.
• Schlegel, H. G.. 1997. “Microbiología general” 9. ed. Barcelona : Omega, 654pp.
• Bailey-Scott 1985 Diagnostic Microbiology
• fai.unne.edu.ar/.../micro-ianez/03_micro.htm Curso de Microbiología General de Enrique Iáñez Actualizado el 17 de agosto de 1998 consultado en agosto de 2006
• http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:Mycobacterial_cell_wall_diagram.png
• http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidoglucano y Schlegel, 1997. “Microbiología general”
• http://www.nupedia.com/newsystem/upload_file/830/bilayer_micelle.png

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